SARS-CoV和SARS-CoV-2的细胞入侵是通过刺突糖蛋白（S）与人类ACE2（hACE2）受体结合开始的。尽管这两种冠状病毒共享一个共同的受体和S的结构，但它们在与hACE2的相互作用以及触发融合机制的S的蛋白酶加工方面存在差异。
了解这些差异如何影响S的激活对于理解其功能和病毒发病机制至关重要。在这项研究中，我们使用氢/氘交换质谱（HDX-MS）研究了hACE2诱导的SARS-CoV和SARS-CoV-2 S的激活过程。
HDX-MS揭示了未结合S的动态变化，包括开放/闭合构象转换和D614G诱导的S稳定性。在与hACE2结合时，观察到与受体结合结构域相邻的区域以及蛋白酶剪切位点和融合肽附近的位点中的顺变异构改变有显著差异。
此外，我们报告了二聚体hACE2，即受体的天然寡聚体形式，与饱和的单体hACE2结合相比，在S中并没有引起更明显的结构效应。这些实验为解析受体诱导的Sarbecovirus刺突蛋白的激活机制提供了机理上的洞察。
在过去的20年里，冠状病毒已经至少三次从动物传播到人类。其中两次涉及的病毒现在被归类为Sarbecovirus亚属，分别是SARS-CoV（严重急性呼吸综合征冠状病毒）和SARS-CoV-2。
SARS-CoV在2002年出现，引发了高致病性感染，但在广泛传播给大规模人群之前被控制住了。首例由SARS-CoV-2病毒引起的COVID-19病例报告于2019年12月。
与SARS-CoV相比，SARS-CoV-2感染具有更长的潜伏期、更高的无症状传播水平和总体更高的传播能力。SARS-CoV-2没有被控制住，一旦在人群中广泛传播，就会出现突变导致的增强传播能力和改变抗原特征的变种。
截至2023年3月，已经有大约7.6亿例感染和680万例死亡的记录（世界卫生组织）。
SARS-CoV和SARS-CoV-2都利用三聚体刺突糖蛋白（S）复合物识别宿主细胞上的hACE2受体。每个S亚单位包括一个受体结合亚单位（S1）和一个融合亚单位（S2），两者之间通过furin蛋白酶剪切位点分隔。
在与hACE2结合之前，细胞内的furin蛋白酶对这两种S糖蛋白具有不同的活性。在SARS-CoV S中，furin对于在位置667的单个精氨酸残基之后的剪切无效。在SARS-CoV-2中，多碱性的RRAR基序增强了furin的活性，导致S蛋白被高效剪切为S1和S2亚单位，与该病毒的增强致病性有关。
冠状病毒刺突蛋白HDX-MS实验概述。(a) SARS-CoV-2 S外域的结构组织（PDB: 6VSB）以及带有SARS-CoV-2 S（上方）和SARS-CoV S（下方）外域的颜色标记的结构域组织，注明了结构域的边界和突变位点。
(b) HDX-MS实验的示意图。
(c) 经过纯化的SARS-CoV、SARS-CoV-2 D614和SARS-CoV-2 G614 S的尺寸排阻色谱。
HDX-MS揭示了SARS-CoV与SARS-CoV-2 S三聚体的结构动态差异。
(a) SARS-CoV-2 D614、SARS-CoV-2 G614和SARS-CoV S的蝶形图显示了刺突序列上动态行为的相似性和差异性。通过对灰色阴影区域的详细比较，展示了SARS-CoV-2 G614 S在30分钟交换时间点的氘摄取热图以及SARS-CoV S与两种形式的SARS-CoV-2 S糖蛋白之间同源肽序列的编号摄取图。
(b) NTD（N末端结构域），(c) RBD（受体结合结构域）和(d) S2亚单位的详细比较，呈现了SARS-CoV-2 G614 S在30分钟交换时间点的氘摄取热图，并显示了SARS-CoV S与两种形式的SARS-CoV-2 S糖蛋白之间同源肽序列的摄取图。
hACE2结合对SARS-CoV-2三聚体束缚RBD和三聚体S的局部和顺变异构效应。
(a) 只在三聚体束缚RBD构型（PDB: 6W41）上观察到局部保护。蓝色表示在hACE2结合后更受保护，红色表示更暴露。
(b) 在与hACE2结合的S三聚体上，相应的RBD在整个RBM区域）显示保护，但在C末端显示更多暴露；铰链区域显示增加的动态性，中央螺旋从融合肽近区域到螺旋顶点显示增加的可访问性。
(c) 在中央螺旋顶点区域，在3秒的氘摄取时间点显示出双峰质量包络。双峰谱被二项分布拟合为两个群体：受保护的群体以蓝色阴影显示，质量较重的群体表示已经采样到一个暴露构象的部分以红色阴影显示。
hACE2结合对SARS-CoV的局部和顺变异构效应。
(a) 在hACE2结合后，RBD在结合界面显示保护，并在C末端显示增加的暴露度；铰链区域显示增加的动态性，中央螺旋显示增加的酰胺可访问性。蓝色表示hACE2结合后更受保护，红色表示更暴露。
(b) 在结合界面的一个区域在3秒的时间点显示出双峰质量包络（PDB: 3D0G）。双峰谱被二项分布拟合为两个群体：受保护的群体以蓝色阴影显示，质量较重的群体表示已经采样到一个暴露构象的部分以红色阴影显示。
展示了hACE2诱导的SARS-CoV和SARS-CoV-2 G614 S的动态变化的相似性和差异性。hACE2与SARS-CoV和SARS-CoV-2 G614 S的结合显示出一个显著的顺变异构效应，从刺突顶端的RBD一直延伸到S2亚单位的中央螺旋区域。
这些动态变化在SARS-CoV-2 G614 S中更为普遍地传递至整个三聚体，特别是在RBD的有序化方面，这是由于SARS-CoV-2刺突与hACE2的结合更为稳定，并且在S2亚单位的中央螺旋区域（HR1-CH）在早期交换时间点上显示出来。在SARS-CoV S中，效应较为缓和，可能是因为hACE2更有可能从该S中解离出来，导致S2亚单位激活的倾向性降低。
hACE2结合对S的动态影响及其对TMPRSS2消化的后续效应。
(a) SARS-CoV-2 S G614和(b) SARS-CoV S的差异蝴蝶图显示了由hACE2结合引起的足迹和顺变效应的变化。灰色阴影突出显示了RBD、融合肽和HR1-CH区域。在早期交换时间点上，SARS-CoV-2 S的S2中央螺旋区域（HR1-CH）显示出更高和更广泛的动力学诱导，超过了SARS-CoV S的情况。
(c) Western blot显示TMPRSS2在SARS-CoV-2 S上的消化更有效。在hACE2结合后，出现了约90 kDa的稳定消化产物。
质粒构建
SARS-CoV S和SARS-CoV-2 S的基因序列进行了编码优化，并进行了二脯氨酸突变，在S1/S2位点进行了SGAG替代C端添加了T4纤维蛋白折叠域、TEV蛋白酶剪切位点和His标签，然后将其合成并克隆到pcDNA3.1(−)载体中。
使用Q5定点突变试剂盒对SARS-CoV-2 S进行了D614G突变。可溶性单体和二聚体hACE2质粒带有His标签，从Addgene购买。使用Sanger测序确认了开放阅读框序列。
瞬时转染
使用上述质粒DNA，将Expi293F培养物转染浓度约为3 × 106个细胞/mL。对于每升培养基，分别用25 mL Gibco Opti-MEM稀释1 mg DNA和3 mg聚乙烯亚胺，孵育5分钟，然后彻底混合。每个转染混合物静置15分钟，然后滴加到培养物中，轻轻旋转混合。转染的培养物在37°C和8% CO2下孵育，摇床转速为125 RPM。
蛋白纯化
在转染后的培养物中，经离心收集上清液，通过0.45μm的αPES过滤器进行真空过滤。向过滤后的上清液中加入Tris盐酸盐和精氨酸盐酸盐，最终浓度为10 mM Tris-HCl和50 mM ArgCl，作为稳定剂。
每升上清液使用5 mL Ni-NTA树脂在室温下进行批处理结合前，先用Tris-ArgCl缓冲液洗涤和平衡树脂2小时。然后将混合物通过可重复使用的重力柱，收集流过液。
将树脂用含有5 mM咪唑酮的洗涤缓冲液洗涤三次。然后使用含有500 mM咪唑酮的洗脱缓冲液进行一次洗脱，共洗脱三次。
对洗脱分数进行SDS-PAGE检查，将其合并并在含0.02% NaN3的Tris-ArgCl缓冲液中进行缓冲交换，然后使用Amicon Ultra-4-ml离心过滤器浓缩到500 μL以下，以备注射。
使用AKTA Pure系统在Superose 6 10/300 GL柱上进行SEC纯化。以Tris-ArgCl作为流动缓冲液，流速为0.5 mL/min，蛋白三聚体在约14 mL处纯化和洗脱，而单体hACE2在约16 mL处洗脱。纯化的蛋白浓缩到1 mg/mL，液氮中快速冷冻，并在-80°C保存以备将来实验使用。
氢/氘交换质谱用于比较SARS-CoV、SARS-CoV-2 D614和SARS-CoV-2 G614可溶性刺突蛋白动力学的实验中，每个样品加入10 μg，在重氘交换缓冲液中在23 °C下孵育4个不同的时间点：3、60、1800和72,000秒。
用于研究hACE2结合影响的实验中，将10 μg SARS-CoV S、10 μg SARS-CoV-2 G614 S和3 μg三聚体SARS-CoV-2 RBD分别与hACE2在23 °C下孵育和平衡过夜。然后将结合和未结合的样品同时在上述相同的重氘交换缓冲液中进行氢/氘交换，孵育时间为3、30、180和900秒。
所有的H/D交换样品立即与等体积的冰冷停止缓冲液磷酸，0.2%甲酸）混合至pH 2.5，并在液氮中快速冷冻。使用Synapt G2-Si质谱仪进行LC-MS分析，使用我们之前的刺突蛋白质组学研究中描述的设置。
将停止的蛋白样品从固定的胃蛋白酶柱中消化为肽段，使用加载缓冲液以400 μL/min的流速进行消化。
肽段在CSH C18陷阱柱上捕获，然后在CSH C18柱上以40 μL/min的流速进行分离，使用20分钟线性梯度从3%到40%缓冲液B（缓冲液A：2%乙腈（ACN），0.1%甲酸（FA），0.025% TFA；缓冲液B：99.9%乙腈（ACN），0.1%甲酸）。
肽段从DriftScope中鉴定，并使用HDExaminer进行分析。所得到的光谱经过二项式拟合，并在Microsoft Excel上使用HX-Express v2可视化。
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