摘要
在过去二十年中，生物制药在改善各种癌症、自身免疫、遗传疾病等患者的生活质量方面取得了突破性进展。随着生物制药需求的不断增长，在不影响产品安全性、质量和功效的前提下，降低制造成本至关重要，越来越多的生物制品以冻干粉针的剂型被不断研究出来并应用于临床。虽然冷冻干燥技术应用于生物制品具有许多优势，但同时生物制品在冷冻干燥的过程中也容易发生蛋白聚集或变性导致药物效价降低。在技术上为了降低冷冻干燥对生物制品的不良影响，往往采用添加辅料或者优化冻干工艺这两种方法。本文综述了可提高生物制品稳定性，应对或降低生物制品变性的冷冻干燥技术以及一些新型冻干技术最新研究进展。
冷冻干燥的原理及过程
冷冻干燥技术是将液态的药液降温冻结成固体，然后在真空环境下进行升华干燥以除去冰晶，升华结束后同样于真空环境下进行解析干燥以除去结合水[1]。针对药物采用冻干工艺其能够保留原有的理化性质、生理活性，降低药物有效成分损失，并且冻干药物制剂通常具有多孔和疏松结构，能够使药物快速恢复其活性以及水分。冻干制剂含有较低水量，利于长期保存，因此药物冻干工艺是药物干燥的有效方法。药物冷冻干燥的过程主要分为4个步骤：预冻、升华干燥（一次干燥）、解析干燥（二次干燥）、密封保存。在药物冻干过程中应满足以下条件：第一，药物固化温度低于其共晶点；第二，升华干燥温度应低于其崩解温度；第三，解析干燥温度应低于其玻璃态转变温度Tg。依照上述步骤冻干后的药品可以室温或冷藏进行长期储存，需要使用的时候，添加合适的溶剂复溶后，便可恢复到冻干前的状态。
改善冻干生物制品变性降解的措施
生物制品在上述冷冻干燥及保存的过程中都有变性的可能[3]。为应对或减少生物制品在冻干过程及长期保存中的变性，通常会采用两种方式，即在处方中添加保护剂和优化冻干工艺。
1.添加保护剂
冻干保护剂是冻干制剂中的一种添加剂，能够减少或阻止冷冻干燥过程对蛋白造成的变性影响。根据冻干冷冻过程和干燥过程对蛋白质施加应力的不同，将蛋白质保护剂的作用机制分为冷冻保护机制和干燥保护机制。保护剂的种类很多，主要包括糖类、多元醇类、氨基酸类、高分子类、表面活性剂等。实际工作中通常根据生物制品的冻干变性特性添加一种或多种保护剂。
2.优化冻干工艺
通过优化冻干工艺，生物类制品在冻干过程及保存期间的稳定性同样也能够得到一定的改善。主要可优化的步骤为预冻、一次干燥（升华干燥）、二次干燥（解析干燥）。预冻的工艺优化——控制冰晶大小根据生物制品的变性机制，在预冻过程中控制冰晶的大小是改善生物制品稳定性的主要方法之一。Geidobler等[5]通过控制冰晶大小的不同制备了牛血清白蛋白和某单克隆抗体的冻干制剂并比较其稳定性。发现通过快速冷冻即预先冷冻隔板的方法制备过程中冰晶较小，一次干燥时间较长，同时制备的冻干粉比表面积较大。一次干燥——改变干燥温度，一次干燥是整个冷冻干燥过程中耗时最长的步骤，同时也是最复杂的步骤。一次干燥理想的状态为在合理的温度下让其尽快升温至平衡温度，且尽可能地缩短平衡温度时间。二次干燥——控制升温速率，二次干燥是冷冻干燥的最后一个阶段。据Tang[6]研究表明，这种慢速的升温方式是对产品质量较为安全的。这一升温速率同样适用于生物制品。
生物制品的创新冻干技术
批量冷冻干燥是制造固体生物制药的主要商业手段。然而，冷冻干燥是一种经济上不友好的生产方式，生产周期长，能耗高，资本投资大，导致总体成本高。本文综述了一些潜在的创新干燥技术。虽然在生物制药行业尚未得到广泛接受，但一些潜在的连续干燥技术为研究开辟了道路，以应对与传统冷冻干燥技术相关的挑战。本综述包括一些创新的干燥技术，即旋转冷冻干燥、悬浮小瓶的连续冷冻干燥、主动冷冻干燥、喷雾冷冻和动态冷冻干燥、Lynfinity®技术、喷雾干燥、PRINT®技术和生物制药的MicroglassificationTM，以及选择干燥工艺的一些考虑因素[7]。
1.常规批次冷冻干燥（Conventional Batch Freeze-drying）
传统的分批冷冻干燥分批冷冻干燥过程涉及根据升华原理从溶液中去除溶剂，通常是水。典型的间歇式冷冻干燥机由一个带多个货架的干燥室、一个冷凝器和一个真空泵组成。冷冻干燥过程包括三个主要步骤：冷冻、一次干燥和二次干燥，见图1。
（图来源于https://www.lyophilizationworld.com/post/2020/03/19/thelyophilization-process.）
图1. 常规间歇冷冻干燥流程
2.单位剂量的旋转冷冻干燥（Spin-freeze-drying of Unit doses）
1957年，Becker首次获得旋转冷冻法专利，专利号DE967120。该方法随后被用于冷冻干燥，并于1965年获得Broadwin的专利，专利号为US3203108A，Oughton等人于1999年获得了US5964043的专利。通过对专利和传统冷冻干燥工艺的修改，作者发明了一种新的单位剂量连续冷冻干燥工艺。这种连续冷冻干燥技术的一个主要特点是含有目标液体产品的小瓶沿其纵轴旋转，因此，这被称为旋转冷冻干燥，见图2。
（图来源于De Meyer et al.，2017；https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2017.09.004.）
图2. 旋转冷冻干燥工艺
该过程从连续旋转冷冻步骤开始，其中含有液体产品的小瓶沿纵轴快速旋转一段时间，通常为2500–3000 rpm。轴向旋转运动导致在小瓶内壁形成分散层，相对均匀的厚度为1 mm。随后，将旋转瓶暴露于温度受控的无菌低温气体流中，如氮气或二氧化碳。由于冷冻产品遍布小瓶内壁，这导致了较大的表面积，从而允许快速均匀地冷冻/加热分散层。凝固过程大约需要1-2分钟，产品的温度通常在-40℃~60◦C之间再持续10-20分钟。为了实现赋形剂的结晶和所需的形态，进一步修改温度控制室中的冷却工艺条件。冷却步骤完成后，小瓶通过传送带系统转移到主干燥室。每个小瓶都保存在具有所需压力和温度条件的腔室中的导热套或口袋中。护套环绕小瓶的外表面，以促进通过传导或辐射均匀分布热量。随后，将小瓶转移至二级干燥室以解吸残余水。图3描绘了连续干燥系统的示意图。干燥步骤持续约30分钟至2小时。据报道，根据小瓶尺寸和产品配方，总加工时间减少了10-40倍。
图3. 连续旋转冷冻干燥系统示意图
总之，这种连续冷冻干燥的概念在减少干燥时间、连续吞吐量和所有单个小瓶的PAT方面具有更大的优势，但是，需要解决在cGMP环境中建立这种连续过程的可行性，以及相关的放大和验证过程。
3. 悬浮小瓶的连续冷冻干燥
最近，根据专利PCT编号WO2018204484，开发了一种称为悬浮小瓶连续冷冻干燥的新概念。如图4所示，冷冻干燥装置由用于不同单元操作的一系列模块组成，这些模块连接在一起，以确保小瓶的连续流动。小瓶悬挂在具有多排的轨道上，允许小瓶通过具有不同温度和压力条件的腔室转移。每个腔室由负载锁定系统隔开，该系统有助于在不同模块之间转移小瓶。当这些小瓶不断装入冷冻干燥机时，它们被填满并部分塞住。灌装后，小瓶进入冷冻区，通过真空诱导表面冷冻技术（VISF）通过自发成核或控制成核进行冷冻。冻结过程中的传热是通过强制空气对流或辐射冷却气体来实现的。产品内温度梯度的显著降低导致通过悬浮小瓶结构形成更大且均匀的孔隙。这进一步导致升华速度更快，因此，与传统冷冻干燥相比，缩短了总干燥时间。此外，受控成核减少了小瓶之间冰晶的不均匀性，从而在小瓶之间形成均匀的多孔结构。
（图来源于https://doi.org/10.1021/acs.iecr.8b02886）
图4. 悬浮小瓶的连续冷冻干燥
4.主动冷冻干燥（Active-freeze-drying）
与托盘式散装冷冻干燥相比，Hosowaka Micron B.V.根据专利号EP1601919A2开发了搅拌式散装冷冻干燥，称为“主动冷冻干燥”。主动冷冻干燥工艺允许以最小的处理量干燥热敏性散装材料，从溶液、悬浮液和糊状物到湿固体。与冻干蛋糕不同，最终的干燥产品是以自由流动的粉末形式获得的。另一个特点是，通过搅拌可以改善某些产品的特性。此外，可以实现更高的传热速率和缩短干燥时间。工艺流程包括夹套锥形真空干燥器、叶轮、收集过滤器、产品收集器、冷凝器和真空泵，如图5所示。
图5. 主动冷冻干燥过程的示意图
5.喷雾冷冻和动态冷冻干燥技术
Meridion Technologies根据赛诺菲巴斯德公司的两项专利开发了SprayCon Lab®喷雾冷冻干燥机，专利号为US10006706B2和US9347707B2。图6显示了生产规模的喷雾冷冻干燥工艺和由Meridion Technologies生产的喷雾冷冻干燥微球的示意图。输送液体容器和喷雾冷冻室位于旋转冷冻干燥机上方，通过一根冷却管和一个将两个工艺区域紧密分隔的活门连接。干燥后的产品通过输送管从干燥室输送到填充容器中。除上述创新的冻干技术，还包括IMA Life连续无菌喷雾冷冻干燥技术、喷雾干燥等新型冻干技术。
图6. Meridion Technologies喷雾冷冻干燥过程示意图和喷雾冷冻干燥微球
总结
随着生物技术的发展，冻干技术在生物制药行业的应用越来越广泛，应用该技术的同时需要根据不同的生物制品特性加入一些保护剂或者是优化冻干工艺以稳定其制品。伴随着冻干保护机制的研究逐步深入，冻干技术也在不断的完善和进步。但是对于生物制品例如蛋白的表征还需要更加深入的认知，稳定性机制还有待进一步深化。而对冻干工艺过程中的某些参数，比如压力、复溶后产品的结构表征和性质是否发生改变等报道甚微，还需要更深一步的了解。尽管面对诸多问题，但是冻干技术仍是保持生物制品稳定性的最有效方法。而开发更加优越的冻干保护剂，提高生物产品的质量是冻干技术的研究热点。
目前，批量冷冻干燥是大多数生物制药产品成熟的干燥技术。许多替代干燥技术在不影响生物制药产品的安全性、质量和功效的前提下，越来越显示出制造固体生物制药的前景。这些潜在的干燥技术对生物制药行业具有重要意义，因为它们不仅可以减少制造救命药物的时间、能源消耗和相关成本，而且有助于降低在新冠肺炎等流行病期间药物供应的任何风险。虽然一些替代方法以较低的运营成本提供连续制造，但温度、剪切等CPP对产品CQA的影响是选择干燥技术的基本要求。虽然干燥技术，即旋转冷冻干燥、喷雾冷冻干燥、喷雾干燥、PRINT®和MicroglassificationTM对某些蛋白质和吸入生物制药的稳定性有积极的影响，但它们对广泛的肠外生物制药的影响尚待研究。通过特定产品的研究，需要有足够的稳定性数据，才能从传统的冷冻干燥转变为连续生产。与CPP一样，选择干燥过程中的配方成分以及产品对于确保产品稳定性至关重要。此外，生物制药与固态特定赋形剂相互作用的分子机制尚不清楚。一些先进的表征技术和PAT串联可以在理解和评估产品-过程关系方面提供更快和深入的分析。虽然大多数替代干燥方法可以通过使用PAT提供显著的好处，但其商业规模的可行性需要进一步探索。在放大、包装和验证方面，一些替代干燥工艺在降低与多个填充饰面单元操作验证相关的复杂性方面具有更大的优势。一些替代干燥技术的商业规模操作已被证明在生物制药行业具有潜力，但一些规模化挑战尚待解决。
由于冻干是一个冗长严苛的脱水过程，优化冻干曲线、缩短冻干时间、保持药物稳定性是对制剂从业人员的一个极大挑战。
康日百奥生物科技（苏州）有限公司冻干制剂无菌灌装团队经验丰富，作为一家专业的生物大分子CDMO服务商，康日百奥生物科技（苏州）有限公司无菌制剂灌装生产车间,包括D级区、C级区和B级区以及B A环境下的无菌灌装区域，所有质量体系已通过欧盟质量受权人审计（QP审计）以及FDA第三方审计，并已取得药品生产许可证。在产能方面，康日百奥拥有西林瓶、冻干、预充针制剂灌装生产线，灌装年产量1500万/年。在设施方面，康日百奥采用智能机器人无菌预灌封系统实现了灌装的高精度以及稳定的无菌保障。
关于康日百奥液体及冻干无菌灌装生产线的优势
商业化西林瓶冻干线
★可以为（2R,6R,8R,10R,15R,20R,50R）规格的水针、冻干制剂提供高效的灌装服务；
★8针头灌装，灌装精度可以稳定控制在±1%；
★单次批量最大：100,000瓶，年水针产量可达400万瓶；配置有全自动进出料系统冻干产能可达100万瓶/年。
无菌预充针、卡式瓶灌装线
★可实现0.2mL-5.0mL不同制剂规格高效切换及连续生产；
★康日百奥引入了智能化的无菌预灌封系统，借助2个超洁净无菌机器人手臂，完全实现了灌装的高精度，提供了稳定的无菌保障，年产能为1000万支。
参考文献
[1] 蔡紫阳. 药物冻干工艺的设计和优化原理. 求医问药(学术版), 2012, 10(12):235.
[2] 王秀杰.药物冻干工艺的设计与优化[J].科技风,2021(06):1-2.
[3] 田烨,吴明媛.生物制品冻干保护方法研究进展[J].中国医药生物技术,2018,13(01):73-76.
[4] Liao YH, Brown MB, Quader A, et al. Protective mechanism of stabilizing excipients against dehydration in the freeze-drying of proteins [J]. Pharm Res, 2002, 19(12):1854-1861.
[5] Geidobler R, Konrad I, Winter G . Can controlled ice nucleation improve freeze-drying of highly-concentrated protein formulations [J]. Pharm Sci, 2013, 102(11):3915-3919.
[6] Tang X, Pikal MJ. Design of freeze-drying processes for pharmaceuticals: practical advice [J]. Pharm Res, 2004, 21(2):191-200.
[7] Sharma A, Khamar D, Cullen S, Hayden A, Hughes H. Innovative Drying Technologies for Biopharmaceuticals. Int J Pharm. 2021;609:121115.
